快速赛车有什么技巧:生物素連接酶

生物素連接酶 (Biotin Ligase)由birA基因編碼所得,能活化生物素形成生物素酰 -5'-腺苷酸,將生物素特異地轉移到生物素受體標簽蛋白(如AviTag 融合蛋白)上,使標簽蛋白生物素化,也可用作生物素操縱子阻礙物。又名為:生物素操縱子阻礙蛋白(biotin operon repressor protein)、birA、生物素酶合成酶(biotin holoenzyme synthetase)、生物素-乙酰輔酶a羧化酶合成酶(biotin-[acetyl-CoA carboxylase] synthetase)。

來源:大腸桿菌 E. coli

儲存緩沖液:50 mM咪唑;50 mM氯化鈉;5%甘油;5 mM巰基乙醇;pH 6.8

儲藏條件:本產品以干冰運送,送達后應立即分裝儲存于-80°C。長期保存置于-80℃,短期內使用置于-20℃,頻繁使用可短時置于4℃。在4℃條件下保存三個月可保持>90% Ligase Buffer A、B和D-Biotin儲存于-20℃,可反復凍融。

活性單位:≥7500 Units/μg

純度:>95%

酶活性單位定義:底物蛋白(多肽)濃度為40 µM的條件下,于30℃孵育30 min,將 1 pmol蛋白(多肽)生物素化所需的酶量定義為一個活性單位。

 

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BI001 Biotin-Protein Ligase(1mg/ml) 將生物素特異地轉移到生物素受體標簽蛋白(如AviTag 融合蛋白)上,使標簽蛋白生物素化 1600

 

 

產品使用指導

根據具體情況,應視乎反應體系添加生物素連接酶量,使生物素?;諞緩俠淼氖奔淝淠誚?如下方圖表所示)。通常,每10 nmol(濃度40 µM)底物建議對應2.5 µg 生物素連接酶,在30°C下反應30-40分鐘,可達到最佳的生物素?;Ч?。

   
 

需要注意的是,在不同生物緩沖液中存在的不同試劑可能抑制生物素連接酶活性,包括NaCl(100 mM)、甘油(5%)、硫酸銨(50 mM)。因此在反應體系中,這些試劑的濃度應盡量最小化。我們推薦將反應底物添加于pH 8,10 mM Tris-HCl中。

 
 

為提高生物素?;?,建議底物在最終反應體系的濃度盡可能高(最高可至40 µM)。反應體系的底物濃度越低,生物素?;氖痹匠?。例如在使用同一birA酶的條件下,40 µM的底物反應時長是30分鐘,4 µM的同一底物反應時長則為5小時。當生物素?;絳榪刂圃?0分鐘內(例如反應速度提高10倍) ,體系中需添加的酶量為原有酶量的10倍。

 

Biotin Ligase Buffer A和Biotin Ligase Buffer B 已經過優化,可在底物(15-mer多肽)濃度不高于40 µM的情況下保持最優的生物素?;?。如底物濃度為40 – 80 µM,則需按以下內容配制反應體系:1份Buffer A、1份Buffer B、7份底物溶液、1份額外添加的生物素。如所需底物濃度高于80 µM,請致電技術支持:020-32069233。

 

生物素連接酶的相關菌株

AVB 100菌株

AVB100是一種大腸桿菌E. coli K12菌株 [MC1061 araD139 delta(ara-leu)7696 delta(lac)l74 galU galK hsdR2(rK-mK+) mcrB1 rpsL(Strr)]。該菌株的染色體帶有穩定轉入的birA基因。

在該菌株中,BirA蛋白的過表達可由阿拉伯糖誘導所得。穩定轉入的birA基因不需使用抗生素維持。在AVB100使用IPTG誘導的載體如Avidity's pAC、pAN、pATN 和pATC AviTag載體,可獨立調控目的基因及BirA的表達水平。該菌株僅限個人研究使用,不可分銷,使用前請閱讀產品的相關許可證明。

AVB99菌株

AVB99是一種帶有pACYC184質粒的大腸桿菌E.coli (XL1-Blue),該質粒包含IPTG誘導的birA基因,可過表達生物素連接酶(pBirAcm),是一個低拷貝數的質粒。培養含該質粒的菌株可使用10 µg/mL濃度的氯霉素。

AVB101菌株

AVB101是大腸桿菌E. coli 的B菌株(hsdR, lon11, su1A1),內含pACYC184質粒,該質粒含有IPTG誘導的birA基因,可過表達生物素連接酶(pBirAcm)。該菌株生長快速且健康,不含添加OmpT或Lon蛋白酶,是理想的蛋白表達工具菌株。

生物素連接酶及AviTag蛋白的表達均由IPTG (1 mM)誘導。誘導階段必須添加生物素,添加至其終濃度為50 µM。pAN及pAC載體需添加氨芐青霉素維持,抗生素濃度建議為100 µg/mL。

Avidity's AVB99及AVB101的質粒特性:

  • 質粒骨架為pACYC184;
  • 其中1.3 Kb片段含有插入了EcoRV位點的lacIq(因此可干擾tetR基因);
  • BirA由乳糖啟動子操縱子調控表達;
  • rrnB終止子結構位于laqIq區域,可破壞pACYC184的XbaI位點。