快速赛车有统一开奖吗:Genome-CRISP™ CRISPR-Cas9 產品與服務

-RNA導向的精確、靈活的基因組編輯工具

介紹

CRISPR-Cas系統(The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems)是一個細菌及古細菌進化出來用以抵御病毒和質粒入侵的適應性機制。CRISPR-Cas系統的高效基因組編輯功能已被應用于多種生物,包括斑馬魚、小鼠、大鼠、秀麗隱桿線蟲、植物及細菌。多個科研小組的研究都顯示,與鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活樣效應核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)相比較,CRISPR-Cas系統介導的基因組靶向實驗在細胞或斑馬魚中具有相似甚至更高的效率。

在II型CRISPR系統中,CRISPR RNA(crRNA)與轉錄激活crRNA(Trans-activating crRNA, tracrRNA)退火形成的復合物能特異識別基因組序列,引導Cas9核酸內切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSBs)。 這個識別復合體可以通過融合crRNA與tracrRNA序列形成sgRNA(single-guided RNA)進行簡化?;蜃櫚陌行蛄兄杏諧ぴ?0bp的片段與crRNA或sgRNA互補配對;靶序列末端的三核苷酸區域PAM(5’-NGG-3’)為Cas9識別位點,是實現剪切功能的關鍵。

CRISPR-Cas9體系的RNA-DNA識別機制為基因 組工程研究提供了一項簡便而強大的工具。該體系其中一個最重要的優勢是Cas9蛋白可在多個不同的gRNA的引導下同時靶向多個基因組位點

圖 1. CRISPR/Cas9介導的基因組編輯原理圖

優勢

  • RNA導向的基因組DNA識別,無需考慮DNA甲基化
  • ZFNTALEN,有相同或更高的基因編輯效率
  • 可同時編輯多個基因(多重靶向編輯)
  • 設計簡單快速,無需重復構建核酸內切酶

 

 

圖2. CRISPR-Cas9介導的基因編輯。(左):sgRNA引導Cas9核酸酶作用于基因組,形成的DSBs被非同源末端連接(NHEJ)機制修復;(右):sgRNA引導Cas9核酸酶作用于基因組,形成DSBs,同源重組(HR)作用下,供體質粒上的目標基因及篩選標記(或其他遺傳元件)在斷裂處被整合進基因組。

 

 

圖3: 切口酶在結合鏈生產單鏈切口的原理圖

 

TALEN 與 CRISPR-Cas9 體系對比

特性

TALEN

CRISPR-Cas9

識別方式

蛋白質 – DNA

RNA-DNA

甲基化敏感性

敏感

不敏感

染色質結構敏感性

敏感

敏感

脫靶效應

較少觀察到脫靶效應

潛在脫靶效應高于 TALEN 及ZFN

多靶點操作

極少用

可用

 

應用

基因組編輯應用

轉錄激活樣效應因子(TAL Effectors)和CRISPR-Cas9可高效且精確地改造細胞系及模式動物的基因組。具體的基因組編輯應用可見下表。

基因組修飾 描述 基因組編輯工具 供體DNA
內源基因標記 利用上融合標簽(如熒光素酶、GFP等)跟蹤內源性啟動子活性或內源性蛋白的表達與定位。 TALEN 或CRISPR 必需
內源基因突變 在內源基因序列中引入點突變 TALEN 或CRISPR 必需
內源基因敲除 引入缺失或插入(如:篩選標記)敲除內源基因 TALEN 或CRISPR 若需建立敲除細胞系,則強烈建議使用。
內源基因表達激活 靶向激活內源基因表達 TALE-TF或 CRISPR-TF 不適用
內源基因表達抑制 靶向抑制內源基因表達 TALE-R 或CRISPR-R 不適用
Safe harbor 位點敲入 敲入外源ORF或其他遺傳因子到人或小鼠基因組的safe harbor位點 TALEN或CRISPR 必需

 

Cas9克隆

Genome-CRISP™ Cas9 核酸酶及 D10A 切口酶表達克隆

Cas9核酸酶克隆表達按照人類密碼子優化過的Cas9核酸酶基因。Cas9切口酶克隆表達一個Cas9 D10A 切口酶基因。該切口酶是一個Cas9突變體,第10位氨基酸從野生型的天冬氨酸突變成了丙氨酸。

CRISPR-Cas9體系是由sgRNA和Cas9核酸酶構成的DNA靶向識別剪切復合體。sgRNA識別一段20bp、3端緊接著5'-N-G-G-3' PAM位點的DNA靶序列,Cas9核酸酶在該靶序列上生成DNA雙鏈斷裂(DSB)。DNA雙鏈斷裂(DSB)會被細胞的非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR)機制修復。NHEJ機制容易在修復的斷裂位點引入插入/缺失突變,造成閱讀框移碼而產生基因敲除的效果。同源重組(HR)需要細胞內同時存在一段帶有靶點同源序列的供體DNA作為修復模板,我們可以通過對供體DNA進行設計,在眾多實驗體系中實現基因敲除或者敲入突變修飾、報告基因等等一系列基因組修飾。

Cas9 D10A切口酶跟野生型的Cas9一樣,也使用sgRNA識別靶序列。但Cas9 D10A切口酶在靶序列上生成的是單鏈切口而非雙鏈斷裂。單鏈切口通?;嵊蒒HEJ和HR以外的機制完美地修復。但通過設計一對定向正確的sgRNA分別識別靶點兩側的DNA雙鏈,我們可以誘導Cas9 D10A分別在靶點兩側的DNA雙鏈上各生成一個單鏈切口,構成一個雙鏈斷裂(DSB),進而誘導NHEJ或HR修復機制。這種雙切口策略常被用在要求低脫靶率的實驗設計中。

 

訂購 貨號 產品 啟動子 報告基因/篩選標記 價格(¥)
Cas9核酸酶表達克隆
CP-C9NU-01 Cas9核酸酶表達克隆 CMV mCherry / Neomycin 1000
Cas9核酸酶慢病毒表達克隆
CP-LvC9NU-01 Cas9核酸酶慢病毒表達克隆 CMV Neomycin 1000
CP-LvC9NU-02 Cas9核酸酶慢病毒表達克隆 CMV eGFP / Neomycin 1000
CP-LvC9NU-08 Cas9核酸酶慢病毒表達克隆 EF1a Puromycin 1000
CP-LvC9NU-09 Cas9核酸酶慢病毒表達克隆 EF1a eGFP / Neomycin 1000
CP-LvC9NU-10 Cas9核酸酶慢病毒表達克隆 EF1a eGFP / Hygromycin 1000
Cas9 D10A 切口酶表達克隆
CP-C9NI-01 Cas9 D10A 切口酶表達克隆 CBh N / A 1000
CP-C9NI-02 Cas9 D10A 切口酶表達克隆 CMV mCherry / Neomycin 1000
sgRNA克隆
  多種 sgRNA克隆 多種 多種
         

* 同時訂購sgRNA克隆時價格減為¥2400

 

訂購 貨號 產品 描述 啟動子 篩選標記/報告基因 載體 價格(¥)
LPP-CP-LvC9NU-01-100

Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒

1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,100 µL.

CMV Neomycin CP-LvC9NU-01 4500
LPP-CP-LvC9NU-02-100

Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒

1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,100 µL. 

CMV eGFP/Neomycin CP-LvC9NU-02 4500
LPP-CP-LvC9NU-08-100

Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒

1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,100 µL.

EF1α Puromycin CP-LvC9NU-08 4500

LPP-CP-LvC9NU-09-100

Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒

1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,100 µL.

EF1α eGFP/Neomycin CP-LvC9NU-09 4500
LPP-CP-LvC9NU-10-100

Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒

1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,100 µL. 

EF1α eGFP/Hygromycin CP-LvC9NU-10 4500
LPP-CP-LvC9NU-01-400

Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒

1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,400 µL.

CMV Neomycin CP-LvC9NU-01 7000
LPP-CP-LvC9NU-02-400 Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒 1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,400 µL. CMV eGFP/Neomycin CP-LvC9NU-02 7000
LPP-CP-LvC9NU-08-400 Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒

1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,400 µL.

EF1α Puromycin CP-LvC9NU-08 7000
LPP-CP-LvC9NU-09-400 Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒 1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,400 µL. EF1α eGFP/Neomycin CP-LvC9NU-09 7000
LPP-CP-LvC9NU-10-400 Cas9 核酸酶純化 Lentifect™ 慢病毒顆粒 1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒顆粒,轉導級,400 µL.  EF1α eGFP/Hygromycin CP-LvC9NU-10 7000


 

Genome-CRISP™ Cas9 穩定表達細胞株

直接轉染或轉導sgRNA便可進行基因組編輯實驗。對于高通量實驗尤其方便。

訂購 新貨號 產品 細胞系 篩選標記 Cas9 整合位點 產品規格 定價(¥)
SL501 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類 H1299 單克隆細胞系 H1299 Puro AAVS1 1管,每管細胞數2×106 10000
SL502 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類 HEK293T 單克隆細胞系 HEK293T Puro AAVS1 1管,每管細胞數2×106 7600
SL503 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的 人類 HeLa 單克隆細胞系 HeLa Hygro AAVS1 1管,每管細胞數2×106 10000
SL504 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的 人類 A549 單克隆細胞系 A549 Hygro AAVS1 1管,每管細胞數2×106 10000
SL505 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類 HEK293T單克隆細胞系 HEK293T Puro AAVS1 1管,每管細胞數2 x106 10000
SL506 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的小鼠 Neuro2a單克隆細胞系 Neuro2a Puro ROSA26 1管,每管細胞數2×106 10000
SL507 穩定表達誘導型 Cas9 核酸酶基因的人類 HEK293T 單克隆細胞系 HEK293T Hygro AAVS1 1管,每管細胞數2×106 10000
SL508 穩定表達誘導型 Cas9 核酸酶基因的小鼠 Neuro2a 單克隆細胞系 Neuro2a Hygro ROSA26 1管,每管細胞數2×106 10000
SL509 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的小鼠 Neuro2a 單克隆細胞系 Neuro2a Hygro ROSA26 1管,每管細胞數2×106 10000
SL510 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的小鼠 Neuro2a 單克隆細胞系 Neuro2a Puro ROSA26 1管,每管細胞數2×106 10000
SL511 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的小鼠 Neuro2a 單克隆細胞系 Neuro2a Neo ROSA26 1管,每管細胞數2×106 10000
SL514 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類MCF- 7單克隆細胞系 MCF- 7 Hygro AAVS1 1管,每管細胞數2×106 10000
SL515 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類MDA-MB-231單克隆細胞系 MDA-MB-231 Hygro 隨機整合 1管,每管細胞數2×106 10000
SL516 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類MDA-MB-468單克隆細胞系 MDA-MB-468 Hygro 隨機整合 1管,每管細胞數2 x106 10000
SL517 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類T47D單克隆細胞系 T47D Hygro AAVS1 1管,每管細胞數2×106 10000
SL518 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類HepG2單克隆細胞系 HepG2 Hygro AAVS1 1管,每管細胞數2×106 10000
SL520 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類AGS單克隆細胞系 AGS Hygro 隨機整合 1管,每管細胞數2×106 10000
SL521 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類BxPC-3單克隆細胞系 BxPC-3 Hygro 隨機整合 1管,每管細胞數2×106 10000
SL522 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類SNU475單克隆細胞系 SNU475 Hygro 隨機整合 1管,每管細胞數2×106 10000
SL523 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類HT-29單克隆細胞系 HT-29 Hygro 隨機整合 1管,每管細胞數 2×106 10000
SL524 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類MCF-7單克隆細胞系 MCF-7 Hygro 隨機整合 1管,每管細胞數 2×106 10000
SL526 穩定表達 Cas9 核酸酶基因的人類SNU‐1單克隆細胞系 SNU‐1 Hygro 隨機整合 1管,每管細胞數 2×106 10000

 

 

 

 

 

sgRNA克隆

Genome-CRISP™ sgRNA設計與克隆定制服務

GeneCopoeia為客戶感興趣的基因提供sgRNA(single-guide RNA)設計與克隆定制服務。sgRNA克隆表達一個單鏈的融合sgRNA(由crRNA和tracrRNA融合而成)。當Cas9核酸酶存在時,sgRNA能識別靶標DNA序列并引導Cas9核酸酶剪切靶標位點,形成DNA雙鏈斷裂(DSBs),進而實現基因敲除、敲入及突變等基因組編輯。多個sgRNA克隆與一個Cas9克隆共轉染可同時在基因組中編輯多個位點,使實驗設計更高效、更靈活。

 

載體類型

載體 啟動子 sgRNA Cas9核酸酶 篩選標記/報告基因 載體圖譜
pCRISPR-SG01 U6 1 或多個 單獨出售* Hygromycin get_info
pCRISPR-LvSG03 U6 1 或多個 單獨出售* Puromycin / mCherry get_info
pCRISPR-CG02 U6 1 載體含有CBh啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因 N/A get_info
pCRISPR-CG04 U6 1或多個 載體含有CMV啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因

Neomycin / copGFP

get_info
pCRISPR-CG07 U6 1 載體含有CBh啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因

Puromycin / copGFP

get_info
pCRISPR-CG08 U6 1 載體含有CBh啟動子啟動表達的Cas9核酸酶基因 mCherry get_info

*配合單獨表達Cas9 核酸酶 (Cat.No. CP-C9NU-01CP-LvC9NU-01CP-LvC9NU-02) 或 Cas9 D10A 切口酶 (Cat.No.CP-C9NI-01, CP-C9NI-02) 的 Cas9 克隆使用。

購買 貨號 產品名稱 篩選標記 報告基因 價格(¥)
CCPCTR01-CG02 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02. Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02. N/A 1100
CCPCTR01-CG04 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04 1100
CCPCTR01-CG07 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07 1100
CCPCTR01-CG08 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 with mCherry. 1100
CCPCTR01-LvSG03 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03 mCherry 1100
CCPCTR01-SG01 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01 Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01 N/A 1100

 

sgRNA Scrambled Control Particles

購買 貨號 產品 描述 啟動子 篩選標記 sgRNA 價格
LPP-CCPCTR01-LvSG03-100 sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒(25 µL×4管) 108 TU/ml sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆,轉導級 EF1a Puromycin CCPCTR01-LvSG03 ¥1200
LPP-CCPCTR01-LvSG03-400 sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒(100µL,25 µL×16管) 108 TU/ml sgRNA 對照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆,轉導級 EF1a Puromycin CCPCTR01-LvSG03 ¥3200

 

 

 

 

Get a Quote

點擊 獲取單靶點或多靶點sgRNA設計和克隆服務的報價。

 

(A)  
HUWEI-sgRNA-design
(B)  
HUWEI-sgRNA_Cas9-clones

圖4. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T細胞中的HUWEI基因。(A)HUWEI-sgRNA與基因組PCR引物設計;(B)在6孔板中,HUWEI-sgRNA/Cas9克隆與sgRNA/Cas9對照克?。ㄓ鏡?)轉染HEK293T細胞。轉染40h后收集細胞,提取基因組DNA并用HUWE特異的PCR引物進行PCR擴增,凝膠純化PCR產物,將純化后的產物與緩沖液混勻,經變性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI經PCR后的產物片段長度應為520bp,T7 ENI剪切后的產物應分別為330bp和190bp。

 

CRISPR-Cas9_multiplexing_to_target_multiple_genes

圖5. CRISPR-Cas9多重靶向編輯多個基因。實驗組(1-4泳道)為Cas9表達克隆及分別表達靶向p53, HUWE1, NCL3 和 GFP基因sgRNA克隆質粒共轉染HEK293t GFP穩轉細胞。對照組(5-8泳道)為Cas9表達克隆質及隨機sgRNA表達克隆的質粒共轉染HEK293t GFP穩轉細胞。通過T7核酸內切酶檢測分析基因組DNA各個靶點上同時存在的插入缺失。*號標記的條帶顯示Cas9核酸酶及分別靶向多個靶點的sgRNA都在目標靶點上有效地誘發了插入缺失突變(1-4道)。PCR產物條帶及T7核酸內切酶酶切產物條帶大?。篏FP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切). 

 

服務

CRISPR-Cas9 客戶定制服務

GeneCopoeia提供基于CRISPR-Cas9體系的靶向基因組修飾因子的設計,構建和驗證服務。

優點

  • 快速生產CRISPR-Cas9實驗體系的質?;騧RNA
  • 進行全序列驗證,可直接用于轉染
  • 提供功能驗證
  • 可提供基因敲入供體克隆

 

相關服務

服務 描述
驗證服務
T7核酸內切酶 I 檢測 染色體水平功能驗證。通過檢測CRISPR-Cas9介導的非同源末端連接(NHEJ)在染色體靶點上生成的插入缺失突變驗證其功能。(圖6& 圖7)
供體克隆服務 供體克隆設計與構建 我們會依據您的實驗需求,提供供體克隆客戶定制服務。供體克隆能將您感興趣的基因、篩選標記或遺傳因子通過CRISPR-Cas9介導的同源重組整合到宿主細胞的基因組內。我們提供一系列含有不同篩選標記及遺傳因子的供體載體設計以滿足您的實驗需求。.
穩轉細胞株服務 單克隆細胞株 含有CRISPR-Cas9介導的基因組修飾的單克隆細胞系。
細胞庫 為含有CRISPR-Cas9介導的基因組修飾的單克隆細胞系建庫。
轉基因小鼠服務 制作轉基因小鼠 攜帶 CRISPR-Cas9 介導的基因組修飾的轉基因小鼠

 

供體載體類型

載體 啟動子 報告基因 篩選標記 LoxP 位點 載體圖譜
pDonor-D01 EF1a copGFP Puromycin N/A get_info
pDonor-D02 CMV copGFP Neomycin N/A get_info
pDonor-D03 CMV N/A Neomycin N/A get_info
pDonor-D04 CMV N/A Puromycin N/A get_info
pDonor-D05 EF1a N/A Neomycin N/A get_info
pDonor-D07 EF1a copGFP Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D08 CMV copGFP Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D09 EF1a N/A Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D10 CMV N/A Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D11 PGK copGFP Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D12 EF1a copGFP Hygromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D13 PGK copGFP Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D14 PGK N/A Puromycin/TK LoxP get_info

資源

用戶手冊

Genome-CRISP™ CRISPR-Cas9 用戶手冊

 

FAQ

基因組編輯常見問題及CRISPR FAQ

 

參考文獻

  • Horvath P, Barrangou R (January 2010). "CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea". Science 327 (5962): 167–70.
  • Marraffini LA, Sontheimer EJ (February 2010). "CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea"Nat Rev Genet 11 (3): 181–190.
  • Hale CR, Zhao P, Olson S, et al. (November 2009). "RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex". Cell 139 (5): 945–56.
  • van der Oost J, Brouns SJ (November 2009). "RNAi: prokaryotes get in on the act". Cell 139 (5): 863–5. doi:10.1016/j.cell.2009.11.018.
  • Hale CR, Zhao P, Olson S, et al. (November 2009). "RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex"Cell 139 (5): 945–56.
  • Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentie E. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptiv bacterial immunity. Science 337, 816–821.
  • Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraf?ni, L.A. (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat.Biotechnol. 31, 233–239.
  • Hsu, P.D., Scott, D.A.,Weinstein, J.A., Ran, F.A., Konermann, S., Agarwala, V.,Li, Y., Fine, E.J., Wu, X., Shalem, O., et al. (2013). DNA targeting speci?city of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. Published online July 21, 2013.

相關產品