快速赛车有什么技巧:基因組編輯供體載體及克隆服務

——易于篩選,應用靈活

介紹

同源重組(HR)是一種修復 DNA 雙鏈斷裂(DSB)的自然機制。靶向特定位點的 TALEN 或 CRISPR-Cas9 體系能夠在基因組上生成 DSB,觸發 DNA 的自然修復機制,誘導基因組與供體 DNA 之間發生同源重組(HR),將供體DNA 片段整合到基因組上的靶標位點來修復 DSB。

這個過程對基因組編輯操作具有極大的價值。按照實驗需求構建的各種供體質粒能在基因組序列中引入多種的修飾。研究者能通過整合報告基因或篩選標記干擾基因的編碼區序列,達到基因敲除的目的,或通過敲入突變序列進行各種閱讀框操作,或者在內源基因序列上融合標簽以對基因進行追蹤等等。(圖1)

圖1. 同源重組介導的基因組編輯。 通過CRISPR/TALEN工具制造DNA 雙鏈斷裂介導同源重組,將供體克隆上的報告基因和篩選標記表達結構靶向整合到基因組上的目標位點。

 

FAQ

基因組編輯常見問題

 

供體載體

GeneCopoeia 提供標準或客戶定制的供體克隆載體,用于基因敲除、突變修飾、融合標簽及其他方面的應用。我們提供帶有不同元件的多種載體骨架,可供客戶根據自己的實驗需要進行選擇。

  • 兩個多克隆位點(MCS),用于裝載左側及右側同源臂序列。
  • 含GFP(可?。┑缺ǜ婊?,用于陽性克隆細胞分選。
  • 含篩選標記,如嘌呤霉素和新霉素抗性基因,用于篩選陽性克隆。
  • 含TK 篩選標記(可?。?,用于負篩選去除含有隨機整合的克隆。
  • 含 LoxP 位點(可?。?,方便在后續實驗中通過Cre-LoxP重組去除整合到基因組中的篩選標記或報告基因序列。

 

載體 啟動子 報告基因 篩選標記 LoxP 位點 載體圖譜
pDonor-D01 EF1a copGFP Puromycin N/A get_info
pDonor-D02 CMV copGFP Neomycin N/A get_info
pDonor-D03 CMV N/A Neomycin N/A get_info
pDonor-D04 CMV N/A Puromycin N/A get_info
pDonor-D05 EF1a N/A Neomycin N/A get_info
pDonor-D07 EF1a copGFP Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D08 CMV copGFP Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D09 EF1a N/A Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D10 CMV N/A Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D11 PGK copGFP Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D12 EF1a copGFP Hygromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D13 PGK copGFP Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D14 PGK N/A Puromycin/TK LoxP get_info

 

購買 Catalog Product Name Description Price
FFPC-C020 Fast-Fusion™ Cloning Kit (20 次反應) 快速有效地進行PCR產物克隆 1500
FFPC-C050 Fast-Fusion™ Cloning Kit (50 次反應) 快速有效地進行PCR產物克隆 3200


供體克隆服務

 

GeneCopoeia 也提供供體克隆設計及/或客戶定制服務以及基因組編輯項目咨詢服務。請填寫以下表格詢價。

 

基因敲除供體克隆

(圖 2A)所示的供體克隆設計構建服務是用于同源重組介導的基因敲除。這類供體克隆能將篩選標記/報告基因表達結構敲入基因組上的靶點,既破壞了基因的閱讀框達到敲除的目的,也使得藥篩或熒光分選陽性細胞系成為可能。這種方法特別適合應用于轉染效率偏低的細胞系,而且同源重組介導的基因敲除還有突變序列已知的優點。

 

用于條件性基因敲除、突變修飾和融合標簽的供體克隆

(圖 2B)所示的供體克隆設計構建服務是用于同源重組介導的基因敲入應用。這類應用包括1)條件性基因敲除(在外顯子兩端插入loxP位點,可利用Cre-loxP重組反應敲除該外顯子);2)基因突變修飾(通過改變特定堿基突變野生型的基因,或將突變基因修復回野生型);3)基因融合標簽(在基因的5‘或3’插入融合標簽蛋白的基因)。此類供體克隆構建服務請填寫以下表格詢價。

 

A

 
 
   

B

 
 
 
圖 2. GeneCopoeia提供的兩種不同的供體克隆設計構建服務。A. 用于基因敲除的供體克隆設計示例。供體克隆帶有藥篩用的篩選標記(Puro)以及一個熒光報告基因(GFP)。藥篩或熒光細胞分選方法適應用于轉染效率偏低的細胞系。注:簡明起見,圖片僅展示一個等為基因。B. 用于突變修飾的基因敲入供體克隆設計示例。上部:帶有單堿基突變的供體克隆與CRISPR sgRNA或TALEN共轉染。一個篩選標記(Puro)和一個熒光報告基因(GFP)被敲入臨近突變位點的內含子區。通過藥篩或熒光細胞分選可以篩選出帶有突變等為基因的克隆。

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