快速赛车下载安装:Genome-TALER™ TALEN 和 TALE定制服務

– 隨心所欲基因組編輯工具

   

介紹

TALEs首先是在植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)中發現的。當感染植物時,病原菌分泌的TALEs識別宿主植物靶基因的啟動子區,調控相應基因的表達。TALE蛋白中間含有一個重復區域,該區域由33-35個氨基酸的重復單元組成。每個重復單元的氨基酸序列高度保守,除了第12位和13位的兩個氨基酸可變,即重復單元可變的雙氨基酸殘基(RVD)。TALE單體通過RVD識別DNA靶點上的堿基,有如下一一對應關系:NI = A, HD = C, NG = T,NN = G 或 A。

轉錄激活因子樣效應子(TAL effectors)已廣泛應用于靶向基因組操作蛋白的制備:通過融合表達核酸酶、轉錄因子或其他功能的結構域構建位點特異的內切酶(TALEN)、靶基因轉錄調控因子(TALE-TFs)或者其他基因組修飾蛋白。TALE融合蛋白通過TALE特異性識別結合染色體上靶序列進行靶向基因組編輯,比如基因敲除、基因敲入(結合使用重組供體質粒)、基因組修飾、基因轉錄激活或抑制等。不同于識別3聯體堿基的鋅指蛋白,TALE單體通過一一對應的關系精確識別單個堿基(A, T, C, G),因此可以針對基因組上任意目標序列設計組建TALE???。

優勢

  • 靶向任意基因,無細胞類型限制
  • 靶點在基因組上序列高度特異
  • 可應用于基因敲除、基因敲入、基因修飾、基因激活或抑制等等
  • 靈活的結合域和功能域設計,可選擇TALEN,TALE-TF或其他TAL效應子

 

圖 1. TALEN設計示意圖

 

圖 2. TALE-TF設計示意圖

TALEN 及 CRISPR-Cas9 體系應用對比

性能 TALEN CRISPR-Cas9
識別類型 蛋白質-DNA RNA-DNA
甲基化敏感性 敏感 不敏感
染色質結構敏感性         敏感 敏感
脫靶效應 較少觀察到脫靶效應               潛在脫靶效應高于 TALENs 及 ZFNs        
多靶點 較少使用 可用

 

參考文獻

  1. Boch, J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 2009 326(5959):1509-12
  2. Moscou, M. et al. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 2009 326(5959):1501
  3. Christian, M. et al. Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases. DOI: 10.1534/genetics.110.120717
  4. Morbitzera, R. et al. Regulation of selected genome loci using de novo-engineered transcription activator-like effector (TALE)-type transcription factors. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1013133107
  5. Cermak, T. et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12   e82 doi:10.1093/nar/gkr218
  6. Li, T. et al. Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 14   6315–6325 doi:10.1093/nar/gkr188
  7. Zhang, F. et al. Programmable Sequence-Specific Transcriptional Regulation of Mammalian Genome Using Designer TAL Effectors. Nat Biotechnol. 2011 February ; 29(2): 149–153. doi:10.1038/nbt.1775.

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應用

基因組編輯應用

TAL 效應子和 CRISPR-Cas9 體系都能用于細胞系或模式生物的精確基因組修飾實驗 。具體的一些基因編輯應用請見下表。

基因組修飾 描述 基因組編輯工具 供體 DNA
融合標簽 通過融合標簽修飾(如熒光素酶、 GFP)追蹤內源啟動子的活動或內源基因的表達與定位 TALEN 或 CRISPR 必須
基因突變 在內源基因序列上引入點突變 TALEN 或 CRISPR 必須
基因敲除 通過引入缺失或插入(如篩選標記序列)敲除內源基因 TALEN 或 CRISPR 強力推薦用于敲除細胞系篩選
表達激活 激活內源基因表達 TALE-TF 或 CRISPR-TF N/A
表達抑制 抑制內源基因表達 TALE-R 或 CRISPR-R N/A
Safe harbor 基因敲入 在人類或小鼠基因組的 safe harbor 位點敲入外源 ORF 或其他遺傳因子 TALEN 或 CRISPR 必須

 

TALEN

TALEN 服務

   

TALEN是由TALE DNA結合結構域和FokI的DNA切割結構域融合構成。一對TALEN分別與兩個相鄰的靶點(相隔14-20bp)特異結合后,使得兩個TALEN的FokI切割結構域靠近形成二聚體,發揮內切核酸酶活性,在兩個靶位點之間剪切,產生雙鏈斷裂(DSBs)。DSBs誘發細胞內DNA損傷修復系統,非同源末端接合機制連接斷裂的DNA時會產生堿基插入、缺失或者突變。另外,存在同源供體雙鏈DNA片段時,同源重組可以將供體DNA整合進斷裂位點。TALENs已用在人胚胎干細胞(ES)和誘導多功能干細胞(IPSCs)的基因修飾穩定株的制備,還用于大鼠,線蟲,斑馬魚等基因敲出動物模型的構建。

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圖 3. TALEN設計示意圖

 

 
   
圖4. TALEN介導的基因敲除。 (左圖) TALEN介導的DNA雙鏈斷裂(DSBs)被非同源末端修復機制修復(NHEJ)。 (右圖) TALEN介導的DNA雙鏈斷裂(DSBs)通過同源重組(HR)敲入供體質粒上的選擇標記(或其他遺傳因子)修復。

 

圖 5. EGFP-TALENs體外切割靶DNA. (A) EGFP TALEN 靶向質粒(6110 bp) 含有一個EcoRI 酶切位點和一個eGFP TALENs的切割位點,相隔約1066 bp. (B)用相應的的酶(EcoRI或者EGFP-TALENs)和 1 µg 靶向質粒37°C孵育30 分鐘后, 取一半的反應產物(約500 ng DNA)進行瓊脂糖凝膠電泳。結果表明EGFP-TALENs特異切割靶向質粒。*號所指的DNA片段通過PCR驗證(未展示數據)
 

 

圖 6. EGFP TALENs 下調靶基因eGFP的表達. (A) eGFP TALENs 表達檢測:轉染eGFP TALEN質粒到HEK293T細胞中(6孔板,轉染0.8 µg質粒每孔)。 48小時后收集細胞,通過western blot檢測EGFP-TALENs的表達(Flag標簽抗體, SDS-PAGE分離膠濃度為8%,EGFP-TALEN分子量約110kDa)。 (B) EGFP TALENs 下調靶基因eGFP的表達: 共轉染EGFP TALENs質粒和EX-EGFP-Lv105 (eGFP表達克隆)到6孔板中的HEK293T 細胞中。48小時后在顯微鏡下觀察EGFP的表達水平。(Nikon Eclipse Ti, 曝光時間: 600ms)。.

 

(A)talen-tale-tf_F4_A-m

*靶向報告質粒中的Gluc報告基因中插入了TALEN靶點-終止密碼子序列, 產生無義突變,不能表達Gluc。
**供體質粒中的野生型Gluc上游沒有啟動子,也不能表達Gluc。該野生型的Gluc可通過同源重組修復靶向報告質粒中的發生雙鏈斷裂的無義突變的Gluc(上游含CMV啟動子),恢復Gluc的表達。

(B)

圖 7. TALENs 促進同源重組 共轉染eGFP-TALENs (1 µg)、靶向報告質粒 (0.5 µg) 和供體質粒 (0.5 µg)到HEK293T細胞中(6孔板)。 48小時后,檢測同源重組修復Gluc的表達水平,以報告質粒中內參基因SEAP做校正因子。

 

TALE-TF

TALE-TF 服務

   

TALEs的一個重要應用是通過TALE DNA結合結構域與轉錄調控結構域融合,靶向激活或抑制細胞內靶基因的表達。TALE-TF結構是真核細胞內選擇性調節基因表達的高度特異性的強大的工具。TALE-TF由TALE DNA結合結構域和VP64 轉錄激活子融合而成,可對真核細胞內靶基因進行精確激活。

圖 8. TALE-TF設計示意圖

購買 貨號 產品 篩選標記 報告基因 價格
CTR001-TF-01 Scrambled control for TALE-TF Scrambled control for TALE-TF Scrambled control for TALE-TF 550

 

圖 9. NTF3 TALE-TF 上調內源性NTF3的轉錄
轉染 NTF3 TALE-TF到HEK293T細胞中 (6 孔板, 每孔轉染1 µg 質粒) 。實時熒光定量PCR檢測表明TALE-TF將HEK293T細胞內NTF3的表達水平提高了17倍左右(以空載體做對照)。

 

talen-tale-tf_F3

圖 10. 合成的TALE激活因子對人類基因表達具有協同作用:(a) 一個TALE結構圖。每個重復單元里被標出的氨基酸可識別以下堿基。

NLS:核定位序列;VP64/p65:激活區(ADs)。(b) 單一TALE以不同效率誘導靶標人類基因表達。 (c) 定點作用于任一DNA單鏈的TALEs可協同作用,有效地提高誘導率。(Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 207-208)

 

服務

TALE定制服務

GeneCopoeia提供TALENs,TALE-TFs和其他基于TALE的靶向基因組修飾因子的設計,構建和驗證服務。

優點

  • 快速生產TALE質?;騧RNA
  • 進行全序列驗證,可直接用于轉染
  • 提供功能驗證
  • 可提供基因敲入供體克隆

 

相關服務

服務

服務內容

應用范圍

驗證服務

T7核酸內切酶I 酶切檢測

染色體水平功能驗證。通過檢測TALEN介導的非同源末端連接(NHEJ)在染色體靶點上生成的插入缺失突變驗證其功能。

TALEN

qPCR檢測

染色體水平功能驗證。通過測量靶基因表達水平的變化,驗證TALE-TF的功能。.

TALE-TF

供體克隆服務

供體克隆設計與構建

我們會依據您的實驗需求,提供供體克隆客戶定制服務。供體克隆能將您感興趣的基因、篩選標記或遺傳因子通過TALEN介導的同源重組整合到宿主細胞的基因組內。我們提供一系列含有不同篩選標記及遺傳因子的供體載體設計以滿足您的實驗需求。.

TALEN

穩轉細胞株服務

單克隆細胞株

含有TALEN介導的基因組修飾的單克隆細胞系。

TALEN

細胞庫

為含有TALEN介導的基因組修飾的單克隆細胞系建庫。

TALEN

轉基因小鼠服務 制作轉基因小鼠 攜帶 TALEN 介導的基因組修飾的轉基因小鼠 TALEN

 

供體載體類型

載體 啟動子 報告基因 篩選標記 LoxP 位點 載體圖譜
pDonor-D01 EF1a copGFP Puromycin N/A get_info
pDonor-D02 CMV copGFP Neomycin N/A get_info
pDonor-D03 CMV N/A Neomycin N/A get_info
pDonor-D04 CMV N/A Puromycin N/A get_info
pDonor-D05 EF1a N/A Neomycin N/A get_info
pDonor-D07 EF1a copGFP Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D08 CMV copGFP Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D09 EF1a N/A Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D10 CMV N/A Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D11 PGK copGFP Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D12 EF1a copGFP Hygromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D13 PGK copGFP Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D14 PGK N/A Puromycin/TK LoxP get_info

資源

用戶手冊

    Genome-TALER™ TALEN 及 TALE-TF 產品和服務 用戶手冊

     

    FAQs

    基因組編輯常見問題及 TALEN & TALE-TF FAQ

     

    技術說明

    Knockout by TALEN or CRISPR vs knockdown by shRNA or siRNA

    CRISPR-Cas9 specificity: Taming off-targent mutagenesis

    Genome editing: Which should I choose, TALEN or CRISPR?

    Genome editing in mammalian cells: What do I do next?

    Genome editing: check out these exciting donor clone applications! 

     

    應用說明

    GeneCopoeia genome editing tools for safe harbor integration in mice and humans

     

    綜述文章

    Genome Editing Technology from GeneCopoeia

     

    參考文獻

    • Richter, A. et al. Designer TALEs team up for highly efficient gene induction. Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 207-208
    • Perez-Pinera, P. et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 239-242
    • Maeder, M.L. et al. Robust synergistic regulation of human gene expression using TALE activators. Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 243-245

     

    相關產品

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    基因組編輯穩定細胞系構建服務 – GeneCopoeia提供使用TALEN或CRISPR-Cas9技術構建的基因組編輯穩定細胞系。我們的穩定細胞系服務也可以兼容我們的人類及小鼠safe harbor基因敲入體系。

     

    轉基因小鼠服務 – GeneCopeia 提供原核顯微注射法生成的帶有 CRISPR 或 TALEN 介導的基因組修飾小鼠。

     

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